解淀菌发酵的营养一孢杆水豆栓及抗氧3种性溶豉的成分化活粉芽

水豆豉是解淀菌发酵以大豆为原料，由芽孢杆菌、粉芽分溶少量乳酸菌及酵母菌等微生物自然发酵获得的孢杆中国传统发酵豆制品。水豆豉富含多种营养物质，种水具有潜在的豆豉的营降血压、降血脂、养成抗氧化等能力，栓及产品豉香浓郁，抗氧风味独特，化活深受消费者的解淀菌发酵喜爱。水豆豉与日本纳豆同是粉芽分溶细菌型豆豉的代表，两者在原料、孢杆菌株、种水工艺等方面较为相似，豆豉的营纳豆有很强的养成溶栓活性，被广泛研究并作为改善血栓类疾病的功能食品而闻名世界。纳豆及部分豆豉具有的溶栓活性主要来自于发酵过程中微生物生长代谢所产的纤溶酶类物质。常见的产纤溶酶菌株主要是枯草芽孢杆菌。虽然解淀粉芽孢杆菌也具有产纤溶酶的能力，但是研究较多的是产酶条件优化及酶学特性等，尚未见用其纯种发酵制备具有溶栓活性的水豆豉的报道。

目前，国内外关于水豆豉的研究较少，且多集中于产品辅料配比和不同工艺流程对产品性质的影响，对水豆豉的活性成分及功能的研究起步较晚。尹爽等研究不同工艺条件下水豆豉曲的氨基酸态氮、水分、总酸等理化指标的变化情况，并对加入的辅料用量进行优化设计。刘佳慧等研究了制曲温度、装载量、制曲时间、生长因子添加量等对水豆豉曲氨基酸态氮含量的影响。冯霞等通过体外抗氧化试验及动物实验发现玻璃容器发酵的水豆豉比陶瓷和塑料容器发酵的水豆豉有更好的抗氧化效果。庞庆芳等发现不同微生物发酵的豆豉中细菌型豆豉的溶栓活性差异显著，其中，自然发酵水豆豉的溶栓活性较低，纯种发酵可能会提高产品的溶栓活性。

本课题组早期从豆豉样品中筛选到1株产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌CAUnDJ118。本文用该菌株发酵大豆类原料（黄豆、黑豆、双青豆）制备3种水豆豉，并研究其营养成分、溶栓及抗氧化活性，为进一步开发能改善心血管疾病的水豆豉功能食品提供试验数据。

1 材料与方法

1. 1材料与试剂

1.1.1 材料

解淀粉芽孢杆菌CAUnDJ118，中国农业大学食品科学与营养工程学院酶工程实验室筛选并保藏；黄豆、黑豆、双青豆，产自黑龙江省齐齐哈尔市；辣椒粉、姜粉、食盐，购于北京市美廉美超市学清路店。

1.1.2 试剂

凝血酶、纤维蛋白原、Gly-Leu、DPPH、ABTS、Trolox、TPTZ，美国SIgma公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英国OxoId公司；芦丁，上海源叶生物科技有限公司；没食子酸，上海麦克林公司；肝素钠，北京拜尔迪公司；其它试剂无特别说明均为国产分析纯级。

1.2 设备与仪器

全温振荡培养箱（HZQ-F160），太仓市豪城实验仪器制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（TYAIB），宁波久兴医疗器械有限公司；恒温水浴锅（DK-S24），上海精宏实验设备有限公司；紫外可见分光光度计（TU-1800PC），北京普析通用仪器设备有限责任公司；酶标仪（ThermoMulTISkanFC），美国ThermoFISherSCIenTIFIC公司。

1.3 方法

1.3. 1种子液培养

将解淀粉芽孢杆菌CAUnDJ118在固体培养基上活化后，挑取1环接入液体种子培养基（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%naCl，pH7.2～7.5），在37℃，200r/min下培养10h左右，当菌落数在109CFU/mL时作为种子液。

1.3.2 水豆豉的制作工艺细菌型水豆豉的制作工艺流程如下：

黄豆、双青豆、黑豆→筛选→浸泡→蒸煮→接种→前酵→后熟→拌料→后酵→成品

选用颗粒饱满、大小均匀、无虫害霉变的黄豆、双青豆、黑豆原料各100g，加入300mL蒸馏水于室温下浸泡18h，浸泡后各类湿豆质量约250g（湿豆质量为干豆质量的2.4～2.5倍为宜）。将浸泡结束后的豆子沥水、分装（直径25Cm的玻璃平皿中装200g湿豆原料），121℃蒸煮灭菌20mIn，冷却后接入湿豆质量5%的解淀粉芽孢杆菌CAUnDJ118种子液，于37℃培养24h，然后置于4℃后熟1d。将灭菌冷却后的调料水（含5%食盐、3%辣椒粉、3%姜粉）按湿豆质量50%的添加量加入后熟完成的豆豉中，于45℃后发酵1d，获得水豆豉成品。

未发酵水豆豉除在接种时将种子液替换成等量无菌水外，其余工艺与发酵水豆豉相同。

1.3.3 样品处理及提取方法

将水豆豉成品放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48～60h，粉碎过20目筛获得水豆豉冻干粉样品，密封保存于-20℃，备用。样品待测液的制备方法如下：

水豆豉冻干粉水提液制备方法：称取5.0g水豆豉冻干粉样品，加入50mL蒸馏水，25℃，200r/mIn摇床浸提2h，10000r/mIn离心10mIn，收集上清液，获得水豆豉样品水提液。水提液中折合水豆豉样品冻干粉含量为100mg/mL。
水豆豉冻干粉醇提液制备方法：称取5.0g水豆豉冻干粉样品，加入15mL体积分数80%甲醇，以480W功率超声处理20mIn后，4000r/mIn离心10mIn获得上清液。重复3次，合并上清液并将提取液体积定容50mL，获得水豆豉样品醇提液。醇提液中折合水豆豉冻干粉含量为100mg/mL。

1.4 活性测定方法

1.4.1 纤溶活性的测定

将1.4mL50mmol硼酸缓冲液、0.4mL0.72%纤维蛋白原溶液混匀后于37℃水浴锅中预热5mIn，加入0.1mL20U/mL凝血酶，混匀，在37℃下反应10mIn待其凝固。将水豆豉冻干粉水提液（100mg/mL）稀释5倍，在反应体系中加入0.1mL水豆豉冻干粉水提液稀释液（20mg/mL），混匀后于37℃下反应60mIn，每隔20mIn振荡混匀1次。反应结束时立刻加入500μL0.2mol三氯乙酸溶液（TCA）终止反应，10000r/min离心10mIn，取上清液在275nm处测定吸光值。阴性对照的处理为先加终止剂TCA溶液，后加样品稀释液。酶活的定义：在上述条件下，与对照相比，测定时所用样品稀释液的吸光值每分钟增加0.01相当于一个酶活单位，单位为FU/mL。根据水豆豉冻干粉水提液中折合水豆豉冻干粉质量，将结果换算为FU/g。计算公式如下：

式中，x—样品溶液的纤溶酶活力，FU/mL；A_r—样品的吸光值；A_C—阴性对照的吸光值；60—反应时间60mIn，以1mIn计；0.1—反应的酶液体积是0.1mL；N—稀释倍数。

1.4.2 抗凝血活性的测定

参考刘梦洁等的方法并稍作调整。纤维蛋白原、凝血酶均用凝血酶均用50mmolpH7.2的TrIS-HCl缓冲液（含0.12mmolnaCl）稀释溶解。将水豆豉冻干粉水提液（100mg/mL）依次稀释10，20，40，80，160，320，640倍获得不同浓度的水豆豉冻干粉水提液稀释液。在96孔板中加入140μL0.1%纤维蛋白原、40μL不同浓度的水豆豉冻干粉水提液稀释液，置酶标仪中，在405nm处测定吸光值。5mIn后加入10μL12U/mL凝血酶，37℃反应10min后在405nm处测定吸光值。阳性对照为等量10mg/mL肝素钠代替样品。空白对照为等量TrIS-HCl缓冲液代替样品。样品的抗凝血活性按下式计算，根据样品浓度与抗凝血活性的关系计算样品的抗凝血活性IC₅₀值。

式中，x—某浓度样品待测液的抗凝血活性百分比，%；A_c10min—反应10mIn后空白对照的吸光度；A_c5min—预热5min后空白对照的吸光度；A_s10min—反应10mIn后样品待测液的吸光度；A_s10min—预热5mIn后样品待测液的吸光度。

1.4.3 多肽含量的测定

采用邻苯二甲醛法测定水豆豉的多肽含量，待测液为稀释20倍的水豆豉冻干粉水提液（5mg/mL），用Gly-Leu二肽作为标准品制作标准曲线，单位为mg/mL，然后根据水豆豉冻干粉质量，将结果换算为mg/g。

1.4.4 氨基酸态氮含量的测定

将部分未冻干处理的水豆豉样品搅拌均匀后放入研钵中，在10mIn内迅速研磨至无肉眼可见颗粒，装入磨口瓶中备用。用已知质量的称量瓶称取搅拌均匀的水豆豉样品5.0g，用50mL80℃的蒸馏水分数次洗入100mL烧杯中，冷却后转入100mL容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，将洗液并入容量瓶中定容100mL，混匀后过滤获得水豆豉待测液。按照国家标准《食品中氨基酸态氮的测定》GB5009.235-2016酸度计法测定水豆豉的氨基酸态氮含量，单位为g/100g。

1.4.5 总酚含量的测定

采用福林（FolIn）-酚试剂法测定水豆豉的总酚含量，将水豆豉冻干粉醇提液（100mg/mL）稀释10倍后作待测液，以没食子酸作为标准品绘制标准曲线，单位为mgGAE/mL，根据水豆豉冻干粉质量将结果换算为mgGAE/g。

1.4.6 总异黄酮含量的测定

参考Herald等的方法测定水豆豉的总异黄酮含量，将水豆豉冻干粉醇提液（100mg/mL）稀释10倍后作待测液，以芦丁为标准品制作标准曲线，单位为mgRE/mL，根据水豆豉冻干粉质量将试验结果换算为mgRE/g。

1.4.7 抗氧化活性的测定

参考DaI等和Gan等的方法测定水豆豉的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、FRAP还原能力。将水豆豉冻干粉醇提液（100mg/mL）分别稀释适宜倍数，得到不同质量浓度的稀释液，测定并计算不同水豆豉冻干粉质量浓度下的DPPH、ABTS清除率。

DPPH、ABTS清除率按下式计算，以Trolox作为标准品制作标准曲线，根据水豆豉冻干粉质量，将结果用μmolTE/g表示。

水豆豉的FRAP还原能力测定以FeSO₄溶液制作标准曲线，换算还原力，待测液的FRAP还原能力单位为μmolFe²⁺/mL，根据待测液中折合水豆豉冻干粉质量进行换算，结果以μmolFe²⁺/g表示。

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